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PCR引物设计的几个原则了解一下

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发布时间:2022/9/19 11:03:11

  PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。如述,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计。

1.  引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.  避开产物的二结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二结构的影响,选择扩增片段时好避开二结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6 lkJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3.  长度

寡核苷酸引物长度为15~30 bp,一般为20~27mer。引物的有效长度:Ln=2(G+C)+(A+T+,Ln值不能大于38,因为>38时,适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的适温度(74℃),不能保证产物的特异性。

4.  G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值好接近72℃以使复性条件佳。

5.  碱基础随机分布

引物中四种碱基的分布好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6.  引物自身

引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7.  引物之间

两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

8.  引物的3′端

引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二结构可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中,引物3′端不能发生错配。

在标准PCR反应体系中,用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP(四种dNTP各200μmol/L)以质粒(103拷贝)为模板,按95℃,25s;55℃,25s;72℃,1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下,引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响是等同的。

9.  引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10.  密码子的简并

如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。

特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的认识,一些引物的计算机设计程序也应运而生,下面将讨论有关引物计算机设计方法。

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