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质粒中的内毒素可能会影响细胞转染效率!

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发布时间:2022/9/16 9:53:25

转染是将外源性基因导入细胞内的一种门技术。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例;化学介导方法中脂质体转染方法较为常用;生物介导方法现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

什么是内毒素?


细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖(LipopolySaccharide,LPS)和蛋白的复合物,当细菌裂解时便会大量释放出来。内毒素单位为EU。

内毒素对试验的影响

内毒素存在大程度地影响转染效率。同时内毒素还可能激活免疫细胞的非特异反应,造成实验中的假阳性。因此,为了保证高转染率和转染细胞高存活率,必须从质粒制备的过程中将内毒素去除。

内毒素和质粒的关系


由于内毒素两亲性和负电荷性,性质类似于DNA,因此在质粒纯化中会伴随质粒一同被纯化出来。质粒中内毒素含量的高低常用EU/?g质粒表示。

按照EU/?g大小,质粒被分为三个别:测序别(>50EU/?g)、转染别(<50EU/?g)和无内毒素别(<0.1EU/?g)。

内毒素对于生物学应用的影响

内毒素会对原代细胞和敏感培养细胞的DNA转染过程造成重要影响,内毒素水平的升高会导致转染效率的急剧下降。而且,使用不含内毒素的质粒DNA对于基因治疗的相关应用至关重要,因为内毒素会导致发热、内毒素性休克综合症,并会在动物和人体上激活补体联反应。内毒素也会干扰如巨噬细胞和B细胞一类免疫细胞的体外转染实验,导致免疫反应的非特异性激活。这些效应还包括对如IL-1和列腺素等免疫介质的诱导性合成。为了避免对实验结果的错误判断,确保塑料制品、培养基、血清和质粒DNA中均无LPS污染十分重要。

不同质粒制备方法中的内毒素污染

内毒素分子的化学结构与性质,以及它们形成胶束结构的倾向性,都使得它们容易与质粒DNA共同被纯化出来。例如,在CsCl超速离心法当中,CsCl结合的DNA很容易被内毒素分子所污染,因为在CsCl中内毒素与质粒——溴化乙锭复合物具有相似的密度。

在大尺寸DNA纯化树脂上,高分子量胶束样内毒素很类似于高分子量的DNA分子;在阴离子交换色谱法当中,内毒素分子上的负电荷能够与阴离子交换树脂相互作用,从而导致内毒素与质粒DNA被共同纯化下来。不过,质粒DNA中内毒素污染的水平很大程度上依赖于所使用的纯化方法。QIAGEN Plasmid Kit和2xCsCl梯度离心法均能够生成较低内毒素含量的高纯度DNA。硅胶悬浆法纯化出的DNA则含有显著升高的内毒素污染。使用EndoFree Plasmid Kit抽提出的DNA仅含有可忽略不计的微量内毒素(<0.1EU /ug质粒DNA)。

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