三代测序技术兴起已经不是一天两天的事情，可是好多小伙伴对它的认知好像仅仅限于一个名词，没有具体去深入了解过，以为可能就是跟现在的二代测序技术没有什么差别，只是升级版而已，小编很负责任的告诉你，在你不知道的时间里，它已经成为科研领域不可或缺的一种主流技术，广泛应用于基因组Denovo、全长转录本检测、宏基因组、重测序和变异检测等多个方向，并且在染色体结构变异（SV）的检测中有着不可替代的优势。

特别是随着近两年 eccDNA（extrachromosomal circular DNA）即染色体外环状DNA成为科研界的宠儿，三代测序技术更是被推上了浪潮的尖端。

第三代测序技术主要有两大技术：

是单分子实时荧光测序，脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度；当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时在DNA链上被探测到；当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。


优点：

（1）可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，即如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来直接检测甲基化等信息

（2）测序速度很快，每秒约10 个dNTP

（3）读长长（约50kb）：超长读长可获得mRNA全长序列及完整结构信息，提高拼接效率，转录本无需拼接；克服无参考基因组物种转录本拼接短、信息不完整的难题；实现有参考基因组物种研究可变剪切及融合基因等结构变异。精准重构转录组/基因组全貌

（4）直接对原始DNA/RNA样本测序，无需PCR扩增，无GC偏好性

（5）需要的样品量很少，样品制备时间花费少

缺点：

（1）测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%

好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错

（2）依赖DNA聚合酶的活性

（3）成本比二代测序较高

第二是纳米孔测序，新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的；由于纳米孔的直径非常小，仅允许单个核苷酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的变化差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。

优点：

（1） 测序读长：大约在几十kb，甚至100 kb，理论上只要DNA分子不断开就可以一直通过纳米孔（比如很火的eccDNA，往往比较大，并且往往携带多个染色质来源的序列，因此仅用二代测序很难完整构建出eccDNA的全长序列。三代测序技术显著提高了测序中分子读长的问题，可以用于eccDNA的全长序列鉴定）

（2） 可以直接读取甲基化的胞嘧啶，不必像二代测序那样需要对基因组进行bisulfite处理（怎么理解：也就是用三代测序做一个全基因组测序的话，可以同时有DNA甲基化的数据分析）

（3） 测序通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成);

（4） 起始DNA在测序过程中不被破坏;

（5） 以及样品制备简单又便宜

缺点：

（1） 测序准确率：Nanopore测序准确率和Pacbio持平，为86%左右。而且起始位置正确率偏低，在大约100nt位置达到稳定，且错误为随机测序错误。如果是对DNA正负链都进行测序，可以达到96%的准确率

（2） 切断的核苷酸可能被读错方向