革兰氏染色是*项经典的细菌鉴别手段，自19世纪80年代丹麦的医师GRAM创立起，至*已经近*个半世纪，仍旧在细菌的检测和鉴定分类上被广泛应用着。在我*，GB 4789系列的*标中很多致病菌的检测也都需要进行革兰氏染色，可见其重要性。甚至可以说没有精准掌握革兰氏染色的微生物检验员，不会是*个合格的检验员。
 

革兰氏染色的原理：

细菌细胞通过结晶紫初染和dian液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与dian的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与dian复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与dian复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

涂片、晾干、固定、染色、水洗、媒染、脱色、复染。此处不加赘述。

影响革兰氏染色结果准确性的关键因素：

1、试剂影响

这是我们*先应该确保的，我们使用的试剂必须是有效的。实验室应当建立有效的试剂管理程序，从试剂的验收到存放、使用、过期后的废弃处理都应有严格规定，确保我们使用的试剂是有效的。工欲善其事必先利其器，这也是我们试验成功*基础的*环。

2、染色菌的选择

菌龄对革兰氏染色结果的影响是十分大的。我们染色过程中选择的菌应该是处于活跃生长期，这样的细菌活性强，生理特征明显，所以染色的结果准确度高，*般情况下不会出现误差。培养时间较长的革兰氏阳性菌，由于细胞老化，甚至有部分菌在染色之*就已经死亡或者自行溶解了，造成细胞壁通透性增加，就会呈现出假阴性。以金黄色葡萄球菌为例，金葡是典型的革兰氏阳性菌，有人曾经统计过培养至不同时间的金葡的革兰氏染色结果，结果表明，在金葡活跃期的22h-26h之间，染色结果的准确率基本可以达到100%，而超过26h之后，准确率就开始下降，培养至36h时，准确率大概会下降30%左右。所以我们在染色时，*定要选择处于活跃期、活性较强的菌落，在检测过程中*定要严格的在*标要求的时间段内进行染色试验，不能提*或者延后。

3、涂菌的状态

在染色*初的涂布中，在挑取菌体后应该在无菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布过程中，若是菌体堆积，也会*大影响染色结果的准确性。菌落堆积过多，往往菌体之间变得毫无缝隙，而其细胞壁的成分影响造成了脱色的情况不佳，容易产生假阳性的结果。同时，在初染、媒染及复染的过程中，应将染液覆盖整个菌膜，避免*部分菌染色而另*部分菌没有染色。因此在涂片过程*定要将菌膜涂得少而均匀，这样才能达到*-佳效果。

4、媒染时间

媒染时间对革兰氏阴性菌的染色结果有很大影响。由于媒染时间过长，结晶紫在dian液长时间作用下过分牢固结合在菌体细胞壁上，影响了酒精的脱色效果，从而会导致这种假阳性的效果。以典型的革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌为例，有人做过统计，媒染时间严格控制在40s-60s之内，染色结果准确率基本可达到100%，而超过60s准确率会有*定的降低，若媒染超过100s，准确率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染过程中*定要注意媒染时间，控制在50-60s为宜。

5、酒精脱色

酒精脱色也是*个对结果影响较大的操作过程。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌*主要的差异是细胞壁肽聚糖层厚度和结构，革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层很薄，脂多糖含量高因此在酒精脱色时，细菌细胞壁的多糖成分会被酒精溶解，增大了细胞壁的通透性，结晶紫及dian复合物就很快被酒精洗脱，之后就会被沙黄复染呈红色；而阳性菌肽聚糖层厚，脂多糖少，酒精只能起到脱水效果而无法进入，这样结晶紫和复合物就无法洗脱出来使细胞呈紫色。因此，酒精脱色时间短，脱色效果不佳，会导致阴性菌菌体内的结晶紫和复合物不能有效的全部洗脱出来，就会出现明显的误差，使阴性菌出现假阳性。而洗脱时间过长，也会导致阳性菌的细胞壁被酒精破坏，导致细胞内的紫色被洗脱，呈现假阴性。因此洗脱时间也是革兰氏染色的关键环节。洗脱时间应当严格控制在20s-30s之间，同时保证洗脱效果。

总结*下，在整个革兰氏染色过程中，在保证试剂有效的*提下，需要严格控制的几个方面：染色菌必须是在其活跃期内，涂布状态不可太厚，媒染时间严格控制在50s-60s之间，脱色时间严格控制在20s-30s。把握以上的关键控制点，革兰氏染色基本就不会出现问题啦！

原创作者：上海远慕生物科技有限公司